Evaluation of metabolic capabilities of Cupriavidus necator to produce polyhydroxyalkanoates using low-cost carbon sources

Abstract

Cupriavidus necator (C. necator) is a bacterium of great biotechnological interest due to its ability to synthesize polyhydroxyalkanoates (PHA), which are biodegradable polymers with industrial applications. The main objective of this study was to evaluate the metabolic capabilities of C. necator for PHA production by integrating different experimental conditions and computational analyses. To achieve this, batch and pulse-fed batch cultures were carried out. For the latter, three different feeding strategies were applied. In the first strategy, two pulses (8.33 mL) of dextrose derived from bitter cassava starch (20 g/L) and ammonium sulfate at a C/N ratio of 73 were added at 24 and 48 h, extending the culture to 120 h. In the second strategy, a single pulse (3.15 mL) of only dextrose (20 g/L) was added at 48 h, with a total cultivation time of 96 h. And in the third strategy, a single pulse (6.14 mL) of only dextrose (20 g/L) was added at 60 h, also extending the culture to 96 h. Batch cultures demonstrated the growth of C. necator, reaching a maximum biomass concentration of 5.17 g/L at 48 h and a polyhydroxybutyrate (PHB) accumulation of 47.1% at the end of the culture (72 h). In the pulse-fed batch cultures, the first strategy extended the exponential growth phase. This led to a gradual accumulation of PHB, reaching a PHB yield of 0.46 g/g and a productivity of 15 mg/(L*h) after 120 h of cultivation. However, the pulse-fed batch cultures, the first strategy resulted in an extended exponential growth phase and gradual PHB accumulation, reaching yields of 0.46 g/g and a productivity of 15.00 mg/(L*h) after 120 hours of cultivation. However, PHB accumulation was 20.57% and 25.12% lower compared to the accumulation observed in the batch culture. In contrast, the third strategy, with a single pulse at 60 h during the stationary phase, resulted in a higher PHB accumulation (52.40%) and productivity (23.22 mg/(L*h)), surpassing the values obtained in batch and the other pulse-feeding strategies. Additionally, the iCNH2025A model represents a refined and highly curated metabolic reconstruction of C. necator, showing significant improvements compared to previous models. With 2,737 reactions, 1,803 unique metabolites, and 1,059 annotated genes, the model integrates key metabolic pathways, including the biosynthesis of PHB and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV), as well as central metabolic routes such as the Calvin-Benson-Bassham cycle (CBB), the Entner-Doudoroff (ED) pathway, the Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway, and the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway (PPP). The model was validated using MEMOTE, achieving a score of 89% and outperforming previous reconstructions such as RehMBEL1391 and iCN1361. In silico growth simulations with fructose and dextrose showed a high correlation with experimental data (R² = 0.76–0.78), validating the model's predictive capacity. Moreover, it accurately captured the carbon flux toward PHB synthesis under various experimental conditions, consistent with previous studies. Thus, the iCNH2025A model represents a significant advancement in the metabolic modeling of C. necator, offering a highly accurate and validated tool for analyzing its metabolism. Its ability to predict metabolic fluxes and growth rates makes it a valuable resource for industrial biotechnology, supporting future optimization strategies in biopolymer production.

Cupriavidus necator (C. necator) es una bacteria de gran interés biotecnológico debido a su capacidad para sintetizar polihidroxialcanoatos (PHA), los cuales son polímeros biodegradables con aplicaciones industriales. El objetivo principal de este estudio fue evaluar las capacidades metabólicas de C. necator para la producción de PHA mediante la integración de diferentes condiciones experimentales y análisis computacionales. Para lograr esto, se llevaron a cabo cultivos por lotes y cultivos alimentados por pulsos. Estos últimos se desarrollaron empleando tres estrategias diferentes: en la primera estrategia se suministraron dos pulsos (8.33 ml) de dextrosa proveniente de almidón de yuca industrial (20 g/L) y sulfato de amonio en una relación C/N de 73.0 a las 24 y 48 horas, extendiendo el cultivo hasta las 120 horas. En la segunda estrategia se suministró un solo pulso (3.15 ml) de dextrosa (20 g/L) a las 48 horas, y el cultivo tuvo una duración de 96 horas, y en la tercera estrategia, se suministró un solo pulso (6.14 ml) de dextrosa (20 g/L) a las 60 horas, extendiendo también el cultivo hasta las 96 horas. Los cultivos por lote demostraron el crecimiento de C. necator, alcanzando una concentración máxima de biomasa de 5.17 g/L a las 48 horas y una acumulación de polihidroxibutirato (PHB) del 47.10% al final del cultivo (72 horas). Con relación a los cultivos lote alimentado por pulsos, para la primera estrategia se observó una extensión de la fase de crecimiento exponencial y una acumulación gradual de PHB, alcanzando rendimientos de 0.46 g/g y una productividad de 15.00 mg/(Lh) tras 120 h de cultivo. No obstante, la acumulación de PHB fue 20.57% y 25.12% menor comparado con la acumulación del cultivo por lote. Por el contrario, la tercera estrategia con pulso a las 60 h en la fase estacionaria permitió una mayor acumulación de PHB (52.40%) y productividad (23.22 mg/(Lh), superando los valores obtenidos en lote y en las otras estrategias. Además, el modelo iCNH2025A representa una reconstrucción metabólica refinada y altamente curada de C. necator, mostrando mejoras significativas en comparación con modelos anteriores. Con 2,737 reacciones, 1,803 metabolitos únicos y 1,059 genes anotados, el modelo integra rutas metabólicas clave, incluyendo la biosíntesis de PHB y de polihidroxibutirato-co-hidroxivalerato (PHBV), así como rutas centrales del metabolismo como el ciclo de Calvin-Benson-Bassham, la vía de Entner-Doudoroff (ED) y la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP). El modelo fue validado utilizando MEMOTE, obteniendo una puntuación del 89% y mostrando mejoras significativas en comparación con modelos anteriores como RehMBEL1391 e iCN1361. Las simulaciones de crecimiento in silico en presencia de fructosa y dextrosa demostraron una alta correlación con los datos experimentales (R² = 0.76–0.78), validando su capacidad predictiva. Además, el modelo reflejó con precisión el flujo de carbono hacia la síntesis de PHB bajo diferentes condiciones experimentales, en concordancia con estudios previos. Así, el modelo iCNH2025A representa un avance significativo en el modelado metabólico de C. necator, proporcionando una herramienta altamente precisa y validada para el análisis de su metabolismo. Su capacidad para predecir flujos metabólicos y tasas de crecimiento lo convierte en un recurso valioso para la biotecnología industrial, facilitando futuras estrategias de optimización en la producción de biopolímeros.